Вплив антибіотиків на біоплівки штамів Pseudomonas aeruginosa з різним рівнем вмісту циклічного дигуанозинмонофосфату
Вантажиться...
Дата
2017
Науковий керівник
Укладач
Редактор
Назва журналу
ISSN
E-ISSN
Назва тому
Видавець
Одеський національний університет імені І. І. Мечникова
Анотація
Мета роботи: встановлення впливу антибіотиків на процес утворення та
зрілу біоплівку штамів P. aeruginosa з різними рівнями вмісту циклічного
дигуанозинмонофосфату (цикло-ди-ГМФ). Методи. Як тест-мікроорганізми використовували штами P. aeruginosa PA01, P. aeruginosa PA01 Δ wspF
(підвищений вміст цикло-ди-ГМФ) і P. aeruginosa PA01 pJN2133 (знижений
вміст цикло-ди-ГМФ). Культивування проводили у пробірках при визначенні
мінімальних інгібувальних концентрацій (МІК) антибіотиків або у 96-лункових плоскодонних планшетах Nuclon у середовищі LB при 37 оС впродовж
24 годин при дослідженні утворення біоплівки. Для оцінки впливу досліджуваних антибіотиків на зрілу біоплівку їх додавали в лунки через добу після
початку інкубації, видаляючи попередньо планктонні клітини. Кількість
планктонних клітин оцінювали спектрофотометрично, масу біоплівки – за
методом забарвлення кристалічним фіолетовим. Результати. Після попередньої оцінки чутливості штамів до широкого спектру антибіотиків за
диско-дифузійним методом Кірбі-Бауера для вивчення були відібрані стрептоміцин, ципрофлоксацин та цефепім, чутливими до яких виявилися усі досліджувані штами. Мінімальні інгібувальні концентрації ципрофлоксацину
і стрептоміцину були однаковими для усіх штамів P. aeruginosa і становили
0,15 та 10 мкг/мл, відповідно. Більш чутливим до цефепіму виявився штам
P. aeruginosa PA01 pJN2133 (МІК 12,5 мкг/мл). МІК цього антибіотику для
двох інших штамів становила 20 мкг/мл. За додавання антибіотиків на початку культивування усі вони ефективно знижували кількість планктонних
клітин (на 70–90%) і масу біоплівок (на 40–70%). При цьому не було встановлено відмінностей між штамами з різнім вмістом цикло-ди-ГМФ. За
впливу на зрілу біоплівку ципрофлоксацин пригнічував утворення клітин персистерів, але знижував масу біоплівки лише у P. aeruginosa PA01 pJN2133.
Цефепім і стрептоміцин знижували вміст персистерів лише у концентраціях 5 і 10 мкг/мл і не чинили впливу на біоплівки. Висновки. Знижений вміст
цикло-ди-ГМФ у клітинах P. aeruginosa підвищує чутливість біоплівок до
антимікробних препаратів. Ципрофлоксацин є найбільш перспективним антибіотиком для розробки комбінованих засобів, здатних запобігати утворенню біоплівок псевдомонадами та руйнувати їх.
Цель работы: установление действия антибиотиков на процесс образования и зрелую биопленку штаммов P. aeruginosa с различными уровнями содержания циклического дигуанозинмонофосфата (цикло-ди-ГМФ).Методы. Как тест-микроорганизмы использовали штаммы P. aeruginosa PA01, P. aeruginosa PA01 Δ wspF (повышенное содержание цикло-ди-ГМФ) и P. aeruginosa PA01 pJN2133 (пониженное содержание цикло-ди-ГМФ). Культивирование проводили в пробирках при определении минимальных ингибирующих концентраций (МИК) антибиотиков или в 96-луночных плоскодонных планшетах Nuclon в среде LB при 37 °С в течение 24 часов при исследовании образования биопленки. Для оценки влияния исследуемых антибиотиков на зрелую биопленку их добавляли в лунки через сутки после начала инкубации, удаляя предварительно планктонные клетки. Количество планктонных клеток оценивали спектрофотометрически, массу биопленки - по методу окраски кристаллическим фиолетовым. Результаты. После предварительной оценки чувствительности штаммов к широкому числу антибиотиков диско-диффузным методом Кирби-Бауэра для изучения были отобраны стрептомицин, ципрофлоксацин и цефепим, чувствительными к которым оказались все исследуемые штаммы. Минимальные ингибирующие концентрации ципрофлоксацина и стрептомицина были одинаковыми для всех штаммов P. aeruginosa и составили 0,15 и 10 мкг/мл, соответственно. Более чувствительным к цефепиму оказался штамм P. aeruginosa PA01 pJN2133 (МИК 12,5 мкг/мл). МИК этого антибиотика для двух других штаммов составляла 20 мкг/мл. При добавлении антибиотиков в начале культивирования все они эффективно снижали количество планктонных клеток (на 70–90%) и массу биопленок (на 40-70%). При этом не было выявлено различий между штаммами с разным содержанием цикло-ди-ГМФ. При воздействии на зрелую биопленку ципрофлоксацин подавлял образование клеток персистеров, но снижал массу биопленки только у P. aeruginosa PA01 pJN2133. Цефепим и стрептомицин снижали содержание персистеров только в концентрациях 5 и 10 мкг/мл и не оказывали влияния на биопленки. Выводы. Пониженное содержание цикло-ди-ГМФ в клетках P. aeruginosa повышает чувствительность биопленок к антимикробным препаратам. Ципрофлоксацин является наиболее перспективным антибиотиком для разработки комбинированных средств, способных предотвращать образование биопленок и разрушать их.
Aim of the study was to determine the effect of antibiotics on the formation process and mature biofilm of strains of P. aeruginosa with different levels of cyclic diguanosine monophosphate (c-di-GMP). Methods. As test microorganisms, strains P. aeruginosa PA01, P. aeruginosa PA01 Δ wspF (elevated level of c-di- GMP) and P. aeruginosa PA01 pJN2133 (reduced level of c-di-GMP) were used. Cultivation was performed in test tubes to determine minimum inhibitory concentrations of antibiotics (MICs) or 96-well flat-bottomed Nuclon plates in LB medium at 37 °C for 24 hours when studying biofilm formation. To assess the effect of the antibiotics on mature biofilm, they were added to the wells one day after the start of the incubation, removing previously plankton cells. The amount of plankton cells was evaluated spectrophotometrically, biofilm mass was determined by the crystalline violet staining method. Results. After preliminary assessment of susceptibility of the strains to a broad range of antibiotics by the disco-diffuse Kirby-Bauer method, streptomycin, ciprofloxacin and cefepime were selected for study, all of the strains tested were susceptible. Minimum inhibitory concentrations of ciprofloxacin and streptomycin were similar for all the strains of P. aeruginosa and were 0.15 and 10 μg/ml, respectively. P. aeruginosa PA01 pJN2133 (MIC 12.5 μg/ml) was more sensitive to cefepime. MIC of this antibiotic for the other two strains was 20 μg/ml. With the addition of antibiotics at the beginning of the cultivation, they effectively reduced number of plankton cells (by 70–90%) and mass of biofilms (by 40–70%). In this case, there was no difference between strains with different content of c-di-GMP. When exposed to mature biofilms, ciprofloxacin suppressed the formation of persistent cells, but reduced the mass of biofilm only in P. aeruginosa PA01 pJN2133. Cefepime and streptomycin reduced the content of persisters only in concentrations of 5 and 10 μg/ml and had no effect on biofilms. Conclusions. The decreased content of c-di-GMP in P. aeruginosa cells increases the sensitivity of biofilms to antimicrobial drugs. Ciprofloxacin is the most promising antibiotic for the development of combined agents that can prevent the formation of biofilms and destroy them.
Цель работы: установление действия антибиотиков на процесс образования и зрелую биопленку штаммов P. aeruginosa с различными уровнями содержания циклического дигуанозинмонофосфата (цикло-ди-ГМФ).Методы. Как тест-микроорганизмы использовали штаммы P. aeruginosa PA01, P. aeruginosa PA01 Δ wspF (повышенное содержание цикло-ди-ГМФ) и P. aeruginosa PA01 pJN2133 (пониженное содержание цикло-ди-ГМФ). Культивирование проводили в пробирках при определении минимальных ингибирующих концентраций (МИК) антибиотиков или в 96-луночных плоскодонных планшетах Nuclon в среде LB при 37 °С в течение 24 часов при исследовании образования биопленки. Для оценки влияния исследуемых антибиотиков на зрелую биопленку их добавляли в лунки через сутки после начала инкубации, удаляя предварительно планктонные клетки. Количество планктонных клеток оценивали спектрофотометрически, массу биопленки - по методу окраски кристаллическим фиолетовым. Результаты. После предварительной оценки чувствительности штаммов к широкому числу антибиотиков диско-диффузным методом Кирби-Бауэра для изучения были отобраны стрептомицин, ципрофлоксацин и цефепим, чувствительными к которым оказались все исследуемые штаммы. Минимальные ингибирующие концентрации ципрофлоксацина и стрептомицина были одинаковыми для всех штаммов P. aeruginosa и составили 0,15 и 10 мкг/мл, соответственно. Более чувствительным к цефепиму оказался штамм P. aeruginosa PA01 pJN2133 (МИК 12,5 мкг/мл). МИК этого антибиотика для двух других штаммов составляла 20 мкг/мл. При добавлении антибиотиков в начале культивирования все они эффективно снижали количество планктонных клеток (на 70–90%) и массу биопленок (на 40-70%). При этом не было выявлено различий между штаммами с разным содержанием цикло-ди-ГМФ. При воздействии на зрелую биопленку ципрофлоксацин подавлял образование клеток персистеров, но снижал массу биопленки только у P. aeruginosa PA01 pJN2133. Цефепим и стрептомицин снижали содержание персистеров только в концентрациях 5 и 10 мкг/мл и не оказывали влияния на биопленки. Выводы. Пониженное содержание цикло-ди-ГМФ в клетках P. aeruginosa повышает чувствительность биопленок к антимикробным препаратам. Ципрофлоксацин является наиболее перспективным антибиотиком для разработки комбинированных средств, способных предотвращать образование биопленок и разрушать их.
Aim of the study was to determine the effect of antibiotics on the formation process and mature biofilm of strains of P. aeruginosa with different levels of cyclic diguanosine monophosphate (c-di-GMP). Methods. As test microorganisms, strains P. aeruginosa PA01, P. aeruginosa PA01 Δ wspF (elevated level of c-di- GMP) and P. aeruginosa PA01 pJN2133 (reduced level of c-di-GMP) were used. Cultivation was performed in test tubes to determine minimum inhibitory concentrations of antibiotics (MICs) or 96-well flat-bottomed Nuclon plates in LB medium at 37 °C for 24 hours when studying biofilm formation. To assess the effect of the antibiotics on mature biofilm, they were added to the wells one day after the start of the incubation, removing previously plankton cells. The amount of plankton cells was evaluated spectrophotometrically, biofilm mass was determined by the crystalline violet staining method. Results. After preliminary assessment of susceptibility of the strains to a broad range of antibiotics by the disco-diffuse Kirby-Bauer method, streptomycin, ciprofloxacin and cefepime were selected for study, all of the strains tested were susceptible. Minimum inhibitory concentrations of ciprofloxacin and streptomycin were similar for all the strains of P. aeruginosa and were 0.15 and 10 μg/ml, respectively. P. aeruginosa PA01 pJN2133 (MIC 12.5 μg/ml) was more sensitive to cefepime. MIC of this antibiotic for the other two strains was 20 μg/ml. With the addition of antibiotics at the beginning of the cultivation, they effectively reduced number of plankton cells (by 70–90%) and mass of biofilms (by 40–70%). In this case, there was no difference between strains with different content of c-di-GMP. When exposed to mature biofilms, ciprofloxacin suppressed the formation of persistent cells, but reduced the mass of biofilm only in P. aeruginosa PA01 pJN2133. Cefepime and streptomycin reduced the content of persisters only in concentrations of 5 and 10 μg/ml and had no effect on biofilms. Conclusions. The decreased content of c-di-GMP in P. aeruginosa cells increases the sensitivity of biofilms to antimicrobial drugs. Ciprofloxacin is the most promising antibiotic for the development of combined agents that can prevent the formation of biofilms and destroy them.
Опис
Ключові слова
цикло-ди-ГМФ, P. aeruginosa PA01, P. aeruginosa PA01 ΔwspF, P. aeruginosa PA01 pJN2133, антибіотики, біоплівка, антибиотики, биопленка, cyclic-di-GMP, antibiotics, biofilm
Бібліографічний опис
Мікробіологія і Біотехнологія = Microbiology & Biotechnology