Поліморфізм генів гліадинів в сучасних українських сортах та лініях пшениці м’якої

Скорочена інформація про документ
dc.contributor.authorПопович, Юлія Андріївна
dc.contributor.authorPopovych, Yuliia A.
dc.date.accessioned2023-11-02T12:48:26Z
dc.date.available2023-11-02T12:48:26Z
dc.date.issued2023
dc.description.abstractДисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 091 – «Біологія» – Одеський національний університет імені І. І. Мечникова. Одеса, 2023. Пшениця м’яка (Triticum aestivum L.) – одна з основних сільськогосподарських культур в Україні та світі. Вона широко використовується у харчовій промисловості та є важливою кормовою базою для тваринництва. Хлібопекарська якість борошна – дуже важлива ознака для селекції, визначається властивостями глютену (клейковини) – комплексу, що складається з високо- (HMW) і низькомолекулярних (LMW) субодиниць глютенінів, з’єднаних дисульфідними зв’язками, які утримуються з гліадинами нековалентними взаємодіями. Саме співвідношенням і поліморфізмом гліадинів та глютенінів у глютеновому комплексі, детермінуються хлібопекарська якість та властивості борошна. Гени глютенінів, на сьогодні добре досліджені та описані, секвеновано та розроблено праймери для цілого ряду алелів, на відміну від гліадинових генів. Основним методом вивчення алельних варіантів гліадинів, на даний момент є електрофорез в кислому ПААГ, який фактично показує фенотип, що визначається набором генів гліадин-кодуючого локусу. Даний метод є складним для використання, оскільки на одній доріжці гелю присутні пептиди, що кодуються усіма гліадин-кодуючими локусами, які можуть перекриватися. Секвенування гліадин-кодуючих локусів та окремих генів гліадинів, здійснене лише для деяких сортів (Wang D. W. et al., 2017; Huo, Zhu et al., 2018; Huo, Zhang et al., 2018; Noma et al., 2015; Camerlengo et al., 2017), показало високий рівень 3 поліморфізму між сортами за кількістю генів, що кодується одним локусом, присутність великої кількості псевдогенів. Тому існує потреба у молекулярних маркерах, які б дозволили визначати алельні варіанти гліадинів за допомогою ПЛР. Це допоможе використовувати гліадини в ході маркер-асоційованої селекції, для ідентифікації алельних варіантів гліадинів ще до отримання зерна, придатного для проведення електрофорезу запасних білків, а також може допомогти об’єднати теоретичні знання, отримані в ході секвенування з конкретним фенотипом – алельними варіантами гліадинів. Таким чином це дозволить вивчати та застосовувати знання про гліадини в комплексі від окремого пептиду до алельного варіанту гліадинів та фенотипу. У зв’язку з цим дана робота присвячена дослідженням поліморфізму гліадинів, що кодуються Gli-1 локусами за допомогою молекулярних маркерів, секвенування та електрофорезу запасних білків в кислому ПААГ. За результатами дослідженння, вперше проаналізовано поліморфізм Gli-A1, Gli-B1 та Gli-D1 локусів з використанням алель-специфічних праймерів, розроблених Zhang et al. (2003), та праймерів до мікросателіту Taglgap на світовій колекції сортів пшениці м’якої, що відображає максимальну різноманітність алельних варіантів гліадинів, що кодуються Gli-B1 локусом (надана для досліджень Є. В. Метаковським) та на сучасній українській колекції сортів та ліній пшениці м’якої із різних селекційних центрів України. За результатами ПЛР з алель-специфічними праймерами до Gli-B1 локусу, виявлено поліморфізм фрагментів амппліфікації Gli-B1.1 та Gli-B1.2 алелів, спричинений мікросателітом всередині послідовності, що ампліфікується (Devos et al., 1995), на основі чого, вперше описано чотири алелі мікросателіту, що виявляються в ПЛР з праймерами до Gli-B1.1 алеля та вісім алелів, що виявляються в ПЛР з праймерами до Gli-B1.2 алеля. З них, сім алелів було секвеновано, отримані нуклеотидні послідовності підтвердили наявність поліморфного мікросателіту із мотивом САА з кількістю повторів від семи (сорт 4 Gabo) до 31 (cорт Chinese-spring). Додатково було використано пару праймерів до мікросателіту Taglgap, яка фланкує послідовність, що перекривається із послідовністю, що фланкується алель-специфічними праймерами, проте є коротшою, а тому дозволяє отримати більш точні розміри фрагментів ампліфікації. Праймери до мікросателіту Taglgap, дозволили виявити 12 алелів у світовій та українській колекціях сортів пшениці м’якої. Отримані результати стали основою для виділення трьох груп та 13 підгруп за поліморфізмом Gli-B1 локусу та демонструють відповідність між наступними генетичними характеристиками «SNP алель Gli-B1 локусу – алель мікросателіту Taglgap – алельний варіант гліадинів». До групи І відносяться чотири підгрупи з Gli-B1.1 алелем, до групи ІІ – вісім підгруп із Gli-B1.2 алелем, а до групи ІІІ – підгрупа 10, із null алелями. Для аналізу генетичного поліморфізму Gli-А1 локусу було застосовано дві пари алель-специфічних праймерів, розроблених Zhang et al. (2003). На відміну від аналогічних праймерів до Gli-В1 локусу, фрагменти ампліфікації Gli-А1.1 та Gli-А1.2 алелів були однакової довжини, що вказана розробниками – 168 п.н. На основі отриманих результатів по Gli-А1 локусу, установлена відповідність між алелями Gli-А1.1/Gli-А1.2 та алельними варіантами гліадинів, що кодуються Gli-А1 локусом. В результаті біоінформаційного аналізу, виявлено мікросателіт, що є частиною кодуючої послідовності гена Gamma gliadin-А1, до якого було розроблено пару праймерів MsA1. Застосування цієї пари праймерів для аналізу української та світової колекції сортів пшениці дозволило виявити вісім різних алелів, які відповідають алельним варіантам гліадинів, що кодуються Gli-A1 локусом. За результатами ПЛР з алель-специфічними праймерами до Gli-D1 локусу у порівнянні із результатами по Gli-A1 та Gli-B1 локусах, виявлена значна кількість гетерогенних сортів. Відповідність між алелями, які визначаються в ПЛР з алель-специфічними праймерами до Gli-D1 локусу не установлена. 5 Біоінформаційний аналіз нуклеотидних послідовностей γ-гліадинових генів та in silico ПЛР показали наявність двох копій послідовності, що ампліфікується із застосуванням алель-специфічних праймерів до Gli-А1 локусу, а також переважання Gli-A1.1 та Gli-D1.1 алелів. Для Gli-B1 локусу знайдено десять алелів мікросателіту Taglgap. В ході біоінформаційного аналізу показано, що нуклеотидні послідовності, що відповідають фрагментам ампліфікації із алель-специфічними праймерами та праймерами до мікросателіту Taglgap, присутні також у ряді інших видів злаків. Це дозволяє використовували дані праймери для молекулярно-генетичного аналізу інших злаків. Отримані результати демонструють можливість використання молекулярних маркерів для ідентифікації алельних варіантів гліадинів, що кодуються Gli-А1, Gli-B1 локусами використовуючи ПЛР.uk_UA
dc.description.abstractThesis of degree of PhD, speciality 091 – “Biology”. – Odesa I.I. Mechnikov National University. Оdesa, 2023. Bread wheat (Triticum aestivum L.) is one of the main agricultural crops in Ukraine and the world. It is widely used in the food industry and is an important fodder base for animal husbandry. The bread-making quality of flour is a very important feature for selection, determined by the properties of the gluten (gluten) complex, which consists of high- (HMW) and low-molecular-weight (LMW) subunits of glutenins connected by disulfide bonds, which are held with gliadins by non-covalent interactions. Polymorphism of gliadins and glutenins in the gluten complex and it`s ratio determine the bread-making quality and properties of flour. In contrast of gliadin genes, the glutenin genes are well studied and described, sequenced and primers designed for a number of alleles. Today, the main method of studying allelic variants of gliadins is electrophoresis in acidic PAGE, which actually shows the phenotype determined by the set of genes of the gliadin-encoding locus. This method is difficult to use, because peptides encoded by all gliadin-encoding loci are present on one lane of the gel and may overlap. Sequencing of gliadin-encoding loci and individual gliadin genes, carried out only for some cultivars (Wang D. W. et al., 2017; Huo, Zhu et al., 2018; Huo, Zhang et al., 2018; Noma et al., 2015; Camerlengo et al., 2017), showed a high level of polymorphism between cultivars in terms of the number of genes encoded by one locus, the presence of a large number of pseudogenes. Therefore, there is a need for molecular markers that would allow the determination of allelic variants of gliadins using PCR. This will help to use gliadins for marker-asissted selection, to identify allelic variants of gliadins even before obtaining grain suitable for electrophoresis of storage proteins, and can also help to 9 combine theoretical knowledge obtained during sequencing with a specific phenotype - allelic variants of gliadins. Thus, it will allow to study and apply knowledge about gliadins in complex from individual peptide to allelic variant of gliadins and phenotype. In this regard, this work is devoted to the study of gliadin polymorphism using the electrophoresis method in acidic PAGE and the search and analysis of polymorphism of Gli-1 loci using molecular markers. Based on the results of the study, the polymorphism of Gli-A1, Gli-B1 and Gli-D1 loci was analyzed using allele-specific primers developed by Zhang et al. (2003), and primers to the Taglgap microsatellite on the world collection of bread wheat cultivars, which reflects the maximum diversity of allelic variants of gliadins encoded by the Gli-B1 locus (provided for research by E. V. Metakovsky) and on the modern Ukrainian collection of cultivars and lines of bread wheat from different Ukrainian selection fnd breeding centers. According to the PCR with allele-specific primers to the Gli-B1 locus results, a polymorphism of the amplification fragments of the Gli-B1.1 and Gli-B1.2 alleles, caused by a microsatellite within the amplified sequence (Devos et al., 1995), was revealed, on the basis of which four alleles of the microsatellite were described for the first time, detected in PCR with primers to the Gli-B1.1 allele and eight alleles detected in PCR with primers to the Gli-B1.2 allele. Seven alleles were sequenced, the obtained nucleotide sequences confirmed the presence of a polymorphic microsatellite with a CAA motif with the number of repeats from seven (Gabo cultivar) to 31 (Chinese-spring cultivar). Additionally, a Taglgap microsatellite primer pair was used, which flanks the sequence that overlaps with the sequence flanked by the allele-specific primers, but is shorter and therefore allows for more accurate amplification fragment sizes. Primers for the Taglgap microsatellite allowed to identify 12 alleles in the worldwide and Ukrainian collections of bread wheat cultivars. Based on the results three groups and 13 subgroups, were separated according to the polymorphism of the Gli-B1 locus which demonstrate the correspondence between "SNP allele of the Gli-B1 locus – allele of the Taglgap microsatellite – allelic variant 10 of gliadins". Group I includes four subgroups with the Gli-B1.1 allele, group II – eight subgroups with the Gli-B1.2 allele, and group III – subgroup 10 with null alleles. To analyze the genetic polymorphism of the Gli-A1 locus, two pairs of allele-specific primers developed by Zhang et al. (2003) were used. In contrast to similar primers for the Gli-B1 locus, the amplification fragments of Gli-A1.1 and Gli-A1.2 alleles were of the same length, as specified by the authors – 168 bp. Based on the results obtained for the Gli-A1 locus, correspondence between the Gli-A1.1/Gli-A1.2 alleles and allelic variants of gliadins encoded by the Gli-A1 locus was established. As a result of bioinformatic analysis, a microsatellite, which is part of the coding sequence of the Gamma gliadin-A1 gene was found, and a pair of primers MsA1 were developed. The use of this pair of primers for the analysis of the Ukrainian and worldwide collections made it possible to identify eight different alleles that correspond to allelic variants of gliadins encoded by the Gli-A1 locus. According to the results of PCR with allele-specific primers for the Gli-D1 locus, in comparison with the results for the Gli-A1 and Gli-B1 loci, a significant number of heterogeneous cultivars were found. Correspondence between alleles determined in PCR with allele-specific primers to the Gli-D1 locus has not been established. Bioinformatic analysis of the nucleotide sequences of γ-gliadin genes and in silico PCR showed the presence of two copies of the sequence amplified using allele-specific primers to the Gli-A1 locus, as well as the predominance of Gli-A1.1 and Gli-D1.1 alleles. Ten alleles of the Taglgap microsatellite were found for the Gli-B1 locus. Bioinformatics analysis showed that nucleotide sequences corresponding to amplification fragments with allele-specific primers and primers to the Taglgap microsatellite are also present in a number of other types of cereals. This allows the use of these primers for molecular genetic analysis of other cereals. Obtained results demonstrate upplication of molecular markers for detecting of allelic variants of gliadins encoded et Gli-А1, Gli-B1 loci using PCR.
dc.identifierУДК 575.17:575.113.2:633.1
dc.identifier.citationПопович Ю. А. Поліморфізм генів гліадинів в сучасних українських сортах та лініях пшениці м’якої : дис. … д-ра філос. : спец. 091 «Біологія» / Ю. А. Попович ; Одес. нац. ун-т ім. І. І. Мечникова. – Одеса, 2023. – 194 с.uk_UA
dc.identifier.urihttps://dspace.onu.edu.ua/handle/123456789/36515
dc.language.isoukuk_UA
dc.subjectпшениця м’якаuk_UA
dc.subjectнасінняuk_UA
dc.subjectзапасні білкиuk_UA
dc.subjectгліадиниuk_UA
dc.subjectGli-А1, Gli-B1 та Gli-D1 локусиuk_UA
dc.subjectалеліuk_UA
dc.subjectполіморфізмuk_UA
dc.subjectПЛРuk_UA
dc.subjectмолекулярно-генетичний аналізuk_UA
dc.subjectалель-специфічні праймериuk_UA
dc.subjectмікросателітні локуси (SSR)uk_UA
dc.subjectмолекулярні маркериuk_UA
dc.subjectбіоінформаційні методиuk_UA
dc.subjectсеквенуванняuk_UA
dc.subjectbread wheatuk_UA
dc.subjectseeduk_UA
dc.subjectstorage proteinsuk_UA
dc.subjectgliadinsuk_UA
dc.subjectGli-A1, Gli-B1, Gli-D1 lociuk_UA
dc.subjectallelesuk_UA
dc.subjectpolymorphismuk_UA
dc.subjectPCRuk_UA
dc.subjectmolecular genetic analysisuk_UA
dc.subjectallele-specific primersuk_UA
dc.subjectmicrosatellites loci (SSR)uk_UA
dc.subjectmolecular markersuk_UA
dc.subjectbioinformatic methodsuk_UA
dc.subjectsequencinguk_UA
dc.titleПоліморфізм генів гліадинів в сучасних українських сортах та лініях пшениці м’якоїuk_UA
dc.title.alternativeGliadin gene polymorphism in modern Ukrainian cultivars and lines of bred wheatuk_UA
dc.typeThesisuk_UA
Файли
Контейнер файлів
Зараз показуємо 1 - 1 з 1
Ескіз
Назва:
Popovych_PhD_Thesis.pdf
Розмір:
7.66 MB
Формат:
Adobe Portable Document Format
Опис:
Завантажити
Ліцензійна угода
Зараз показуємо 1 - 1 з 1
Ескіз недоступний
Назва:
license.txt
Розмір:
1.71 KB
Формат:
Item-specific license agreed upon to submission
Опис:
Завантажити
Зібрання
Дисертації БФ