Дисертації БФ

Permanent URI for this collection

https://dspace.onu.edu.ua/handle/123456789/35139

Browse

Browsing Дисертації БФ by Author "Попович, Юлія Андріївна"

Now showing 1 - 1 of 1
  • Thumbnail Image
    Item
    Поліморфізм генів гліадинів в сучасних українських сортах та лініях пшениці м’якої
    (2023) Попович, Юлія Андріївна; Popovych, Yuliia A.
    Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 091 – «Біологія» – Одеський національний університет імені І. І. Мечникова. Одеса, 2023. Пшениця м’яка (Triticum aestivum L.) – одна з основних сільськогосподарських культур в Україні та світі. Вона широко використовується у харчовій промисловості та є важливою кормовою базою для тваринництва. Хлібопекарська якість борошна – дуже важлива ознака для селекції, визначається властивостями глютену (клейковини) – комплексу, що складається з високо- (HMW) і низькомолекулярних (LMW) субодиниць глютенінів, з’єднаних дисульфідними зв’язками, які утримуються з гліадинами нековалентними взаємодіями. Саме співвідношенням і поліморфізмом гліадинів та глютенінів у глютеновому комплексі, детермінуються хлібопекарська якість та властивості борошна. Гени глютенінів, на сьогодні добре досліджені та описані, секвеновано та розроблено праймери для цілого ряду алелів, на відміну від гліадинових генів. Основним методом вивчення алельних варіантів гліадинів, на даний момент є електрофорез в кислому ПААГ, який фактично показує фенотип, що визначається набором генів гліадин-кодуючого локусу. Даний метод є складним для використання, оскільки на одній доріжці гелю присутні пептиди, що кодуються усіма гліадин-кодуючими локусами, які можуть перекриватися. Секвенування гліадин-кодуючих локусів та окремих генів гліадинів, здійснене лише для деяких сортів (Wang D. W. et al., 2017; Huo, Zhu et al., 2018; Huo, Zhang et al., 2018; Noma et al., 2015; Camerlengo et al., 2017), показало високий рівень 3 поліморфізму між сортами за кількістю генів, що кодується одним локусом, присутність великої кількості псевдогенів. Тому існує потреба у молекулярних маркерах, які б дозволили визначати алельні варіанти гліадинів за допомогою ПЛР. Це допоможе використовувати гліадини в ході маркер-асоційованої селекції, для ідентифікації алельних варіантів гліадинів ще до отримання зерна, придатного для проведення електрофорезу запасних білків, а також може допомогти об’єднати теоретичні знання, отримані в ході секвенування з конкретним фенотипом – алельними варіантами гліадинів. Таким чином це дозволить вивчати та застосовувати знання про гліадини в комплексі від окремого пептиду до алельного варіанту гліадинів та фенотипу. У зв’язку з цим дана робота присвячена дослідженням поліморфізму гліадинів, що кодуються Gli-1 локусами за допомогою молекулярних маркерів, секвенування та електрофорезу запасних білків в кислому ПААГ. За результатами дослідженння, вперше проаналізовано поліморфізм Gli-A1, Gli-B1 та Gli-D1 локусів з використанням алель-специфічних праймерів, розроблених Zhang et al. (2003), та праймерів до мікросателіту Taglgap на світовій колекції сортів пшениці м’якої, що відображає максимальну різноманітність алельних варіантів гліадинів, що кодуються Gli-B1 локусом (надана для досліджень Є. В. Метаковським) та на сучасній українській колекції сортів та ліній пшениці м’якої із різних селекційних центрів України. За результатами ПЛР з алель-специфічними праймерами до Gli-B1 локусу, виявлено поліморфізм фрагментів амппліфікації Gli-B1.1 та Gli-B1.2 алелів, спричинений мікросателітом всередині послідовності, що ампліфікується (Devos et al., 1995), на основі чого, вперше описано чотири алелі мікросателіту, що виявляються в ПЛР з праймерами до Gli-B1.1 алеля та вісім алелів, що виявляються в ПЛР з праймерами до Gli-B1.2 алеля. З них, сім алелів було секвеновано, отримані нуклеотидні послідовності підтвердили наявність поліморфного мікросателіту із мотивом САА з кількістю повторів від семи (сорт 4 Gabo) до 31 (cорт Chinese-spring). Додатково було використано пару праймерів до мікросателіту Taglgap, яка фланкує послідовність, що перекривається із послідовністю, що фланкується алель-специфічними праймерами, проте є коротшою, а тому дозволяє отримати більш точні розміри фрагментів ампліфікації. Праймери до мікросателіту Taglgap, дозволили виявити 12 алелів у світовій та українській колекціях сортів пшениці м’якої. Отримані результати стали основою для виділення трьох груп та 13 підгруп за поліморфізмом Gli-B1 локусу та демонструють відповідність між наступними генетичними характеристиками «SNP алель Gli-B1 локусу – алель мікросателіту Taglgap – алельний варіант гліадинів». До групи І відносяться чотири підгрупи з Gli-B1.1 алелем, до групи ІІ – вісім підгруп із Gli-B1.2 алелем, а до групи ІІІ – підгрупа 10, із null алелями. Для аналізу генетичного поліморфізму Gli-А1 локусу було застосовано дві пари алель-специфічних праймерів, розроблених Zhang et al. (2003). На відміну від аналогічних праймерів до Gli-В1 локусу, фрагменти ампліфікації Gli-А1.1 та Gli-А1.2 алелів були однакової довжини, що вказана розробниками – 168 п.н. На основі отриманих результатів по Gli-А1 локусу, установлена відповідність між алелями Gli-А1.1/Gli-А1.2 та алельними варіантами гліадинів, що кодуються Gli-А1 локусом. В результаті біоінформаційного аналізу, виявлено мікросателіт, що є частиною кодуючої послідовності гена Gamma gliadin-А1, до якого було розроблено пару праймерів MsA1. Застосування цієї пари праймерів для аналізу української та світової колекції сортів пшениці дозволило виявити вісім різних алелів, які відповідають алельним варіантам гліадинів, що кодуються Gli-A1 локусом. За результатами ПЛР з алель-специфічними праймерами до Gli-D1 локусу у порівнянні із результатами по Gli-A1 та Gli-B1 локусах, виявлена значна кількість гетерогенних сортів. Відповідність між алелями, які визначаються в ПЛР з алель-специфічними праймерами до Gli-D1 локусу не установлена. 5 Біоінформаційний аналіз нуклеотидних послідовностей γ-гліадинових генів та in silico ПЛР показали наявність двох копій послідовності, що ампліфікується із застосуванням алель-специфічних праймерів до Gli-А1 локусу, а також переважання Gli-A1.1 та Gli-D1.1 алелів. Для Gli-B1 локусу знайдено десять алелів мікросателіту Taglgap. В ході біоінформаційного аналізу показано, що нуклеотидні послідовності, що відповідають фрагментам ампліфікації із алель-специфічними праймерами та праймерами до мікросателіту Taglgap, присутні також у ряді інших видів злаків. Це дозволяє використовували дані праймери для молекулярно-генетичного аналізу інших злаків. Отримані результати демонструють можливість використання молекулярних маркерів для ідентифікації алельних варіантів гліадинів, що кодуються Gli-А1, Gli-B1 локусами використовуючи ПЛР.