Кіка, Владислав ВолодимировичKika, Vladyslav V.2024-05-102024-05-102024Кіка В. В. Експериментальне дослідження стану кісткової тканини за умов розвитку хронічної алкогольної інтоксикації : дис. … д-ра філос. : 091 Біологія 09 Біологія / В. В. Кіка ; наук. кер. Макаренко О. А. ; Одес. нац. ун-т ім. І. І. Мечникова. – Одеса, 2024. – 172 с.https://dspace.onu.edu.ua/handle/123456789/38086Кіка В. В. Експериментальне дослідження стану кісткової тканини за умов розвитку хронічної алкогольної інтоксикації. Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук (доктора філософії) за спеціальністю 091 Біологія - Одеський національний університет імені І. І. Мечникова, Одеса, 2024. Дисертаційна робота присвячена дослідженню стану кісткової тканини у лабораторних щурів з хронічною алкогольною інтоксикацією, а також обґрунтуванню комплексної профілактики порушень, які є наслідком інтоксикації. Для реалізації мети і виконання завдань дисертаційної роботи проведено дві серії експериментів на лабораторних щурах. Щурів під час досліджень утримували згідно правил роботи з експериментальними тваринами, що встановлені Директивою Європейського парламенту та Ради (2010/63/EU), наказом Міністерства освіти і науки, молоді та спорту України від 01.03.2012 р. № 249. Тварини під час проведення експериментів знаходилися на постійному харчовому та питному режимі віварію ОНУ імені І. І. Мечникова. Завданням першого етапу роботи було дослідження стану деяких кісток у щурів з хронічною алкогольною інтоксикацією за морфометричними параметрами, показниками антиоксидантної системи, маркерами ремоделювання. Також у тварин визначали стан слизових оболонок травного тракту за показниками всмоктування, засвоєння кальцію, запалення, антиоксидантного захисту, перекисного окиснення ліпідів, ступеня дисбіозу. Для з’ясування головної ланки патогенезу остеодистрофії при алкогольній інтоксикації висновки дослідження робили на підставі різниці отриманих даних у осібин різної статі. Дослід проводили на 14 самцях і 14 самках, поділених порівну на інтактну та дослідну групи. Інтактні групи отримували воду, дослідні групи замість води отримували розчин етанолу. Розчин алкоголю був єдиним джерелом рідини для тварин. Початкова концентрація спирту 5 %, далі збільшували концентрацію на 2 % кожні 10 днів (протягом 50 днів), протягом наступних 58 днів тварини вживали 15 % розчин спирту. Тривалість експерименту - 108 днів. Отримані результати показали, що тривале введення щурам етанолу посилює атрофію альвеолярного відростку на 15,0 % у самців та на 18,0 % у самиць, що свідчить про активацію резорбції кісткової тканини щелеп. Хронічне вживання алкоголю призвело до збільшення кількості каріозних уражень на 34,1 % у самців і на 40,0 % у самок (р < 0,02). В стегнових кістках і поперекових хребцях алкоголізованих самок встановлена тенденція до збільшення вмісту мінерального компоненту і зменшення вмісту органічного компоненту. Щільність кісток самок не змінювалась, але порушилось співвідношення мінерального та органічного компоненту у кістковій тканині. У самців такого перерозподілу не відбулося. Дослідження активності антиоксидантних ферментів у кістковій тканині обох статей виявило їх зміну внаслідок прийому алкоголю: спостерігали зріст активності каталази на 33,3-38,6 %, падіння активності супероксиддисмутазы на 15,6-18,3 % і глутатіоноредуктази - на 33,1-39,4 %. У кістковій тканині самиць порушення активності усіх ферментів було значнішим, що супроводжувалось вираженим розвитком перекисного окиснення ліпідів, а саме - збільшенням вмісту малонового діальдегіду на 75,3 %, що було статистично вище, ніж у самців (р < 0,001). Навпаки, підвищення маркерів резорбції (активності еластази та кислої фосфатази) у щелепах внаслідок алкоголізації достовірно більш виражено у самців на тлі зменшення показника кісткоутворення (активності лужної фосфатази), яке було також значнішим у щелепах самців. Тому більш виражені порушення стану антиоксидантно-прооксидантної системи в кістковій тканині алкоголізованих самиць можуть пояснити значнішу атрофію альвеолярного відростку щелеп та зміни в співвідношенні мінерального та органічного компонентів в стегнових кістках та поперекових хребцях, а значить і погіршення якості кісткової тканини самок. Дослідження всмоктування, екскреції та засвоєння кальцію встановило зниження абсорбції цього елементу у тонкій кишці алкоголізованих тварин однаково у обох статей. При цьому у самців кількість виведеного кальцію була статистично менше ніж у самок, що розглядається як компенсаторна реакція на зниження його всмоктування у тонкій кишці. А у самок внаслідок хронічної алкоголізації констатували гірше засвоєння кальцію, так як при зменшенні всмоктування у тонкій кишці цей елемент в більшій кількості ніж у самців виводився з сечею і калом. Хронічна алкогольна інтоксикація викликала запальні та дисбіотичні явища у травному тракті тварин, чим можна пояснити порушення всмоктування і засвоєння кальцію. Так, встановлено активацію кислої фосфатази (на 22,7-58,6 %) разом з еластазою (на 20,0-55,5 %) як у всіх слизових оболонках шлунково-кишкового тракту, так і особливо у печінці щурів (57,4-112,6 %), що свідчить про розвиток запалення, яке більшою мірою виражено у самців. Запалення носило генералізований характер, оскільки активність еластази суттєво зростала у сироватці алкоголізованих щурів. Хронічне введення етанолу щурам сприяло також розвитку дисбіозу у травному тракті, що супроводжувалось суттєвим зниженням антимікробного фактору активності лізоциму (на 26,4-70,0 %) та зростанням активності уреази (на 21,3-139,5 %). Найбільш значущі зміни виявлено у слизовій оболонці шлунку тих щурів обох статей, де зареєстровано найвища активність уреази при повній відсутності лізоциму. В слизових оболонках травного тракту, печінці та сироватці крові щурів внаслідок тривалого вживання етанолу встановили зниження активності антиоксидантного ферменту каталази, що супроводжувалося суттєвим збільшенням вмісту малонового діальдегіду (на 16,1-25,0 %). Отримані результати вказують на пригнічення антиоксидантного захисту та розвиток оксидативного стресу внаслідок хронічного вживання алкоголю, що більшою мірою було виражено у самок щурів. Оскільки оксидативний стрес у травному тракті, збільшення екскреції кальцію та зменшення його засвоєння значніше виражено у алкоголізованих самок, а ступінь активації запальних та дисбіотичних процесів - з деякою перевагою у самців, саме оксидативний стрес при хронічній алкогольній інтоксикації є причиною погіршення засвоєння кальцію, що робить додатковий негативний вклад у розвиток алкогольної остеодистрофії. Виснаження антиоксидантного захисту і розвиток оксидативного стресу за умов хронічної алкоголізації зареєстровано також в головному мозку щурів. На підставі встановлення розвитку оксидативного стресу у кістковій та травній системах внаслідок хронічної алкогольної інтоксикації, обґрунтували дві схеми корекції прооксидантного впливу етанолу за допомогою комплексів препаратів з вмістом неферментних антиоксидантів (кверцетин, аскорбінова кислота) і кофакторів антиоксидантних ферментів (цинк, марганець, селен). Враховуючі збільшення екскреції кальцію внаслідок алкогольної інтоксикації, основою першого комплексу обрали кальцій з раковин устриць з вітаміном D, основу другого комплексу склав препарат Мінерол та вітаміни D і С для кращого засвоєння кальцію. На наступному етапі досліджували ефективність застосування запропонованих комплексів при тривалій алкоголізації щурів. Експеримент проводили на самках щурів, так як на першому етапі було встановлено більш виражені патологічні зміни у кістковій та травній системах самок. Тварини були випадковим чином поділені на чотири групи: інтактну та три групи з алкогольною інтоксикацією, двом з яких вводили мінерально - вітамінний комплекс на основі кальцію з раковин устриць 500 мг/кг або комплекс на основі препарату Мінерол 1000 мг/кг. Тварини поступово адаптувались до прийому алкоголю: перші 7 днів - 8 % розчин, наступні 7 днів - до 16 %, далі до кінця досліду - 25 % розчин етанолу. Тривалість експерименту становила 104 дні. Профілактичну остеопротекторну ефективність запропонованих комплексів для корекції встановлених порушень оцінювали у кістках щурів за морфометричними параметрами, показниками антиоксидантної системи, маркерами ремоделювання. Також у тварин визначали стан слизових оболонок травного тракту за показниками запалення, антиоксидантного захисту, перекисного окиснення ліпідів, ступеня дисбіозу. Результати досліджень другого етапу підтвердили негативний вплив хронічного введення етанолу на якість кісткової тканини, а саме - посилення резорбційних процесів, більш значне у щелепах і в деякій мірі - у стегнових кістках самок щурів. Показники поперекових хребців тварин були незмінними. Біохімічні дослідження кісткової тканини виявили наявність оксидативного стресу (зниження активності антиоксидантних ферментів, накопичення малонового діальдегіду), активацію деструктивних ферментів в кістках при одночасному гальмуванні маркеру кісткоутворення, зниження вмісту кальцію у щелепах і стегнових кістках алкоголізованих тварин. Тривале вживання етанолу також викликало порушення у печінці та слизових оболонках травного тракту тварин: оксидативний стрес, запалення, посилення мікробної контамінації, холестаз, порушення метаболізму ліпідів. Введення шурам з хронічною алкогольною інтоксикацією мінерально- вітамінного комплексу на основі кальцію з раковин устриць ефективно попереджувало розвиток порушень у кістках тварин, тобто виявило виражені антиоксидантні та остеопротекторні властивості. Навпаки, при вживанні комплексу «Мінерол» погіршився стан стегнових кісток та не змінились показники ремоделювання та антиоксидантного захисту у кістковій тканині. Профілактичне застосування комплексів з метою корекції порушень, які індукує алкогольна інтоксикація, виявило загальний антиоксидантний вплив комплексів, а також гепатопротекторну дію в умовах тривалого надходження етанолу. Використання обох комплексів у самиць на тлі хронічної алкогольної інтоксикації сприяло ефективному зменшенню проявів оксидативного стресу, запалення, мікробної контамінації в слизових оболонках травного тракту. Порівняння профілактичної ефективності комплексів показало, що мінерально-вітамінний комплекс на основі раковин устриць краще попереджував розвиток порушень у кістковій тканині та сироватці крові алкоголізованих щурів ніж Мінеролом. У слизових оболонках травного тракту та печінці тварин при хронічній алкогольній інтоксикації мінерально- вітамінний комплекс і Мінерол мали однакову коригуючу дію. Загальний висновок досліджень стосується виражених антиоксидантних властивостей запропонованих комплексів, що доказує обґрунтовану патогенетичну профілактику, використання якої ефективно припиняло головну ланку патогенезу алкогольної інтоксикації - оксидативний стрес у кістковій та травній системах щурів.Kika V.V. Experimental research of the bone tissue quality with chronic alcohol intoxication. Qualifying scientific work on manuscript rights. Dissertation for obtaining the scientific degree of Candidate of Biological Sciences (Doctor of Philosophy) in the specialty 091 Biology Odesa I. I. Mechnikov National University, Odesa, 2024. The dissertation is devoted to the study of bone tissue in laboratory rats with chronic alcohol intoxication, as well as the substantiation of the comprehensive prevention of disorders resulting from intoxication. The aim of the first stage of the work was to study the condition of some bones in rats with chronic alcohol intoxication by morphometric parameters, parameters of the antioxidant system, and markers of remodeling. The condition of the mucous membranes of the digestive tract was also studied in animals in accordance with the indicators of absorption, calcium absorption, inflammation, antioxidant defense, lipid peroxidation, and the degree of dysbiosis. To determine the main link in the pathogenesis of osteodystrophy in alcohol intoxication, the study was based on the sex difference in pathological changes in the bone and digestive systems of female and male rats. The experiment was conducted on 14 males and 14 females, divided equally into intact and experimental groups. The intact groups received water, and the experimental groups received ethanol solution. Alcoholization of animals was carried out according to the scheme when the alcohol solution is the only source of liquid for animals. The initial concentration of alcohol was 5 %, then the concentration was increased by 2 % every 10 days (for 50 days), and for the next 58 days the animals consumed a 15 % alcohol solution. The duration of the experiment was 108 days. The results showed that prolonged ethanol administration to rats increased atrophy of the alveolar process by 15.0 % in males and 18.0 % in females, indicating activation of jaw bone resorption. Chronic alcohol consumption increased the number of carious lesions by 34.1 % in males and 40.0 % in females (p < 0.02). In the femurs and lumbar vertebrae of alcoholic females, there was a tendency to increase the contents of the mineral component and decrease the content of the organic component. The bone density of females did not change, but the balance of mineral and organic components in bone tissue was disturbed. No such redistribution occurred in males. The study of the activity of antioxidant enzymes in the bone tissue of both sexes revealed their change as a result of alcohol intake: an increase in catalase activity by 33.3-38.6 %, a decrease in superoxide dismutase activity by 15.6-18.3 % and glutathione reductase activity by 33.1-39.4 % were observed. In the bone tissue of females, the impairment of the activity of all enzymes was more significant, accompanied by a pronounced development of lipid peroxidation, specifically, an increase in the content of malondialdehyde by 75.3 %, which was statistically higher than in males (p < 0.001). On the contrary, the increase in resorption markers (elastase and acid phosphatase activity) in the jaws due to alcoholization is significantly more expressed in males against the background of a decrease in bone formation (alkaline phosphatase activity), which was also more significant in the jaws of males. Therefore, more significant disorders of the antioxidant-prooxidant system in the bone tissue of alcoholized females may explain the more significant atrophy of the alveolar process of the jaws and changes in the proportion of mineral and organic components in the femurs and lumbar vertebrae, and hence the deterioration of the quality of bone tissue in females. A study of calcium excretion and absorption revealed a decrease in the absorption of this element in the small intestine of alcoholized animals in both sexes. At the same time, the amount of excreted calcium in males was statistically less than in females, which is considered a compensatory reaction to a decrease in its absorption in the small intestine. And in females, as a result of chronic alcoholization, worse calcium absorption was noted, since with a decrease in absorption in the small intestine, this element was excreted in urine and feces in greater quantities than in males. Chronic alcohol intoxication caused inflammatory and dysbiotic effects in the digestive tract of animals, which can explain the impaired absorption and absorption of calcium. Thus, the activation of acid phosphatase (by 22.7-58.6 %) together with elastase (by 20.0-55.5 %) was found in all mucous membranes of the gastrointestinal tract, and especially in the liver of rats (57.4-112.6 %), indicating the development of inflammation, which is more expressed in males. The inflammation was generalized, as the activity of elastase increased significantly in the serum of alcoholized rats. Chronic administration of ethanol to rats also contributed to the development of dysbiosis in the digestive tract, which was accompanied by a significant decrease in the antimicrobial factor of lysozyme activity (by 26.4-70.0%) and an increase in urease activity (by 21.3-139.5%). The most significant changes were detected in the gastric mucosa of rats of both sexes, where the highest urease activity was recorded in the complete absence of lysozyme. In the mucous membranes of the digestive tract, liver and blood serum of rats due to prolonged use of ethanol, a decrease in the activity of the antioxidant enzyme catalase was found, accompanied by a significant increase in the content of malondialdehyde (by 16.1-25.0%). The obtained results indicate the suppression of antioxidant defense and the development of oxidative stress due to chronic alcohol consumption, which was more pronounced in female rats. Since oxidative stress in the digestive tract, increased calcium excretion and decreased calcium absorption are more pronounced in alcoholic females, and the degree of activation of inflammatory and dysbiotic processes is slightly higher in males, it is oxidative stress in chronic alcohol intoxication that causes impaired calcium absorption, which makes an additional negative contribution to the development of alcoholic osteodystrophy. The decrease in antioxidant defense and the development of oxidative stress under conditions of chronic alcoholization were also recorded in the rat brain. Based on the finding of the development of oxidative stress in the bone and digestive systems due to chronic alcohol intoxication, two methods of correction of the prooxidant effect of ethanol using complexes of drugs containing nonenzymatic antioxidants (quercetin, ascorbic acid) and cofactors of antioxidant enzymes (zinc, manganese, selenium) were substantiated. Given the increase in calcium excretion due to alcohol intoxication, the first complex was based on calcium from oyster shells with vitamin D, the second complex was based on Mineral and vitamins D and C for better calcium absorption. The next stage was to investigate the effectiveness of the proposed complexes in the case of prolonged alcoholization of rats. The experiment was conducted on female rats, since at the first stage, more pronounced pathological changes in the bone and digestive systems of females were found. Animals were randomly divided into four groups: intact and three groups with alcohol intoxication, two of which were administered a mineral and vitamin complex based on calcium from oyster shells 500 mg/kg or a complex based on Mineral 1000 mg/kg. The animals gradually adapted to alcohol intake: for the first 7 days - 8% solution, for the next 7 days - up to 16%, then until the end of the experiment - 25% ethanol solution. The duration of the experiment was 104 days. The preventive osteoprotective efficacy of the proposed complexes for the correction of the established disorders was evaluated in rat bones by morphometric parameters, antioxidant system parameters, and markers of remodeling. The state of the mucous membranes of the digestive tract was also determined in animals by indicators of inflammation, antioxidant defense, lipid peroxidation, and the degree of dysbiosis. The results of the second phase confirmed the negative effect of chronic ethanol administration on bone quality, namely, an increase in resorption processes, more significant in the jaws and to some extent in the femurs of female rats. Indicators of the lumbar vertebrae of the animals were unchanged. Biochemical studies of bone tissue revealed the presence of oxidative stress (decreased activity of antioxidant enzymes, accumulation of malondialdehyde), activation of destructive enzymes in bones with simultaneous inhibition of bone formation markers, and decreased calcium content in the jaws and femurs of alcohol-exposed animals. Prolonged ethanol consumption also caused disorders in the liver and mucous membranes of the digestive tract of animals: oxidative stress, inflammation, increased microbial contamination, cholestasis, and lipid metabolism. The administration of a calcium-based mineral and vitamin complex from oyster shells to shrews with chronic alcohol intoxication effectively prevented the development of bone disorders, i.e., showed pronounced antioxidant and osteoprotective properties. On the contrary, the use of the Mineral complex worsened the condition of the femurs and did not change the indicators of remodeling and antioxidant protection in bone tissue. Prophylactic use of the complexes to correct the disorders induced by alcohol intoxication revealed the general antioxidant effect of the complexes, as well as hepatoprotective effect under conditions of prolonged ethanol intake. The use of both complexes in females with chronic alcohol intoxication contributed to an effective reduction in the manifestations of oxidative stress, inflammation, and microbial contamination in the mucous membranes of the digestive tract. Comparison of the preventive efficacy of the complexes showed that the mineral and vitamin complex based on oyster shells better prevented the development of disorders in bone tissue and blood serum of alcoholic rats than Mineral. In the mucous membranes of the digestive tract and liver of animals with chronic alcohol intoxication, the mineral-vitamin complex and Mineral had the same corrective effect. Based on the antioxidant properties of the components of the complexes, a reasonable pathogenetic prophylaxis was substantiated, the use of which effectively stopped the main link in the pathogenesis of alcohol intoxication - oxidative stress in the bone and digestive systems of rats.ukщурихронічна алкогольна інтоксикаціякісткова тканинаостеодистрофіяоксидативний стрестравний трактбіохімічні показникизапаленнядисбіоззасвоєння кальціюлікувально-профілактичний комплексантиоксидантиratschronic alcohol intoxicationbone tissueosteodystrophyoxidative stressdigestive tractbiochemical markersinflammationdysbiosiscalcium absorptiontherapeutic and prophylactic complexantioxidantsThesis57.084:611.018.4:615.099:612.393(043.5)