Роль дисбіозу у розвитку печінкової остеодистрофії
Вантажиться...
Дата
2023
Науковий керівник
Укладач
Редактор
Назва журналу
ISSN
E-ISSN
Назва тому
Видавець
Анотація
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук (доктора філософії) за спеціальністю 091 Біологія – Одеський національний університет імені І. І. Мечникова, Одеса, 2023.
Дисертаційна робота присвячена з’ясуванню ролі розвитку дисбіозу у патогенезі остеодистрофії, яка індукована патологією печінки або жовчного міхура у лабораторних щурів, а також обґрунтуванню профілактики дисбіозу та порушень у кістковій тканині, які викликані гепатобіліарною патологією.
Для реалізації мети і виконання завдань дослідження заплановано проведення трьох експериментів на лабораторних щурах. Під час досліджень щурів утримували згідно правил роботи з експериментальними тваринами, встановлених Директивою Європейського парламенту та Ради (2010/63/EU) та наказом Міністерства освіти і науки, молоді та спорту України від 01.03.2012 р. № 249, щури знаходилися на постійному харчовому та питному режимі віварію ОНУ імені І. І. Мечникова.
Завданням першого етапу роботи було дослідження стану головного відділу травного тракту, в якому відбувається всмоктування поживних речовин – слизової оболонки тонкої кишки у щурів з токсичним гепатитом, що моделювали шляхом введення гідразинсульфату у дозі 50 мг/кг два рази на тиждень протягом місяця. За визначенням біохімічних показників запалення у печінці (активністю еластази та кислої фосфатази), «печінкових» маркерів у сироватці крові (активністю аланінамінотрансферази, лужної фосфатази і вмісту білірубіну) констатували запалення паренхіми та пошкодження клітин печінки, тобто наявність токсичного гепатиту у тварин. Стан слизової оболонки тонкої кишки щурів оцінювали за показниками запалення (активністю еластази та кислої фосфатази), контамінацією умовно-патогенними бактеріями (активністю уреази), антимікробного фактора (активністю лізоциму) та ступенем дисбіозу. На тлі розвитку токсичного гепатиту у слизовій оболонці тонкої кишки було зареєстровано ознаки запалення, зниження антимікробного захисту, посилене розмноження патогенної мікробіоти та розвиток дисбіозу. Встановлені зміни в печінці та тонкій кишці щурів вказують на порушення однієї з важливих функції печінки – антимікробної, внаслідок чого спостерігали збільшення показнику контамінації умовно-патогенною мікробіотою та розвиток дисбіозу у слизовій оболонці тонкої кишки.
Отримані результати дозволяють висловити припущення: запалення та дисбіоз у слизовій оболонці тонкої кишки тварин з патологією печінки призведе до погіршення останнього етапу гідролізу поживних речовин та їх всмоктування у кров та лімфу. У свою чергу дефіцит необхідних компонентів може викликати дистрофічні зміни у тканинах та органах, зокрема у кістках тварин з гепатобіліарною патологією.
Тому на наступному етапі роботи були проведені поширені дослідження по всмоктуванню кальцію та амінокислот на ізольованій ділянці тонкої кишки, ступеню засвоєння кальцію, як головного компоненту кісткової тканини, проникності стінки тонкої кишки, маркерів запалення та дисбіозу у всіх відділах травного тракту самців і самок щурів, яким моделювали токсичний гепатит шляхом введення сірчанокислого гідразину у дозі 50 мг/кг двічі на тиждень протягом трьох місяців. За морфометричними показниками (атрофія альвеолярної кістки, щільність, вміст мінерально-органічного компонента, окремо мінеральної і органічної складової кісток) було проведено дослідження стану альвеолярної кістки щелеп, стегнових, великих гомілкових кісток, поперекових хребців, а також окремо епіфізу та діафізу стегнових кісток щурів з хронічним токсичним гепатитом.
Отримані результати складу периферичної крові, біохімічний аналіз сироватки крові та тканини печінки щурів, яким вводили розчин сірчанокислого гідразину двічі на тиждень протягом трьох місяців, вказують на наявність ураження печінки та загального запалення у тварин, що можна трактувати як прояв токсичного гепатиту. Одним з негативних наслідків токсичного пошкодження печінки є зниження її здатності виконувати антимікробну функцію та знешкоджувати умовно-патогенні бактерії та їх токсини.
Тривале введення щурам гідразинсульфату призвело до зниження всмоктування та засвоєння кальцію у слизовій оболонці тонкої кишки, що частково компенсувалося гальмуванням екскреції нирками цього елемента. Кальцій, який не всмоктався у кров із тонкої кишки тварин, виводився з калом. Хронічний гепатит не впливав на всмоктування амінокислот у слизовій оболонці тонкої кишки. Проведене дослідження встановило недостатність засвоєння кальцію у травному тракті щурів з хронічним гепатитом. На ізольованій ділянці тонкої кишки тварин показано збільшення у 2,2-3,5 рази проникності її стінки у щурів з гепатитом, яке більш виражене у самців.
Результати біохімічного дослідження ясен та слизових оболонок тонкої і товстої кишки щурів з токсичним гепатитом вказують на розвиток запалення, пошкодження клітин, інтенсифікацію перекисного окиснення ліпідів (зростання активності еластази на 21,9-39,0 %, кислої фосфатази на 1,7-97,9 %, вмісту малонового діальдегіду на 22,8-60,9 %) зниження неспецифічного антимікробного захисту, підвищення контамінації умовно-патогенними бактеріями та розвиток дисбіозу (збільшення активності уреази на 12,4-179,4 %, ступеня дисбіозу у 2,2-10,5 рази на тлі зниження активності лізоциму на 26,1-90,4 %) у досліджуваних відділах травного тракту тварин. Встановлені порушення були більш виражені у щурів самців з хронічним токсичним гепатитом.
Морфометричні дослідження кісток щурів показали, що моделювання гепатиту не вплинуло на стан зубів, тобто на каріозний процес як самок, так і самців. Водночас розвиток хронічного токсичного гепатиту у самців щурів сприяв підвищенню ступеню атрофії альвеолярного відростку щелеп і зменшенню щільності діафізу стегнової кістки, що свідчить про активацію резорбційних процесів у кістковій тканині. Моделювання патології у самок викликало протилежний ефект, а саме не вплинуло на атрофію альвеолярної кістки, але призвело до достовірного підвищення щільності поперекових хребців, великих гомілкових кісток, стегнових кісток та їх епіфізу. Визначення мінеральної та органічної частки поперекових хребців, великих гомілкових кісток та діафізу стегнових кісток встановило, що збільшення їх щільності у самок з гепатитом відбувалося завдяки підвищенню мінеральної складової кісткової тканини. Зменшення щільності діафізу стегнових кісток у самців з токсичним гепатитом відбувалося за рахунок зниження мінеральної частки кісткової тканини.
Біохімічні дослідження кісткової тканини альвеолярного відростку та стегнових кісток щурів також показали різноспрямовані процеси у кістковій тканині самок та самців з токсичним гепатитом. Так, у кістковій тканині самок з гепатитом встановлено більш інтенсивне руйнування органічної матриці під впливом кісткової еластази та компенсаторне підвищення остеогенезу за участю кісткової лужної фосфатази (зростання активності еластази на 31,2-39,8 %, підвищення активності лужної фосфатази на 61,7-77,3 %), чим можна пояснити підвищення щільності хребців у самок при патології. Тривале введення сірчанокислого гідразину самцям призвело до протилежних процесів у кістковій тканині, а саме – до більш активного руйнування гідроксиапатиту під впливом кісткової кислої фосфатази (зростання активності кислої фосфатази на 88,3-93,7 %), зниження вмісту кальцію – на 16,9-18,3 %, результатом чого стало відповідно зменшення мінеральної частки та щільності кісток. Цим і можна пояснити збільшення резорбції альвеолярної кістки щелеп, а також тенденцію до зниження мінеральної частки кісткової тканини і щільності всіх кісток, що досліджували, у самців щурів з гепатитом.
Встановлені закономірності дозволяють твердити про негативний вплив гепатиту на метаболізм і склад кісткової тканини щурів із компенсаторною участю естрогенів, які, як відомо, уповільнюють швидкість ремоделювання кісткової тканини і запобігають патологічній резорбції.
Таким чином, результати другого етапу дослідження дозволяють підтвердити припущення про те, що порушення антимікробної функції печінки при гепатиті веде до розвитку дисбіотичних явищ, запалення, інтенсифікації перекисного окиснення ліпідів у слизових оболонках травного тракту, зокрема тонкої кишки, тварин з хронічним токсичним гепатитом. Встановлені патологічні зміни призводять до зниження всмоктування кальцію у слизовій оболонці тонкої кишки та недостатності його засвоєння у травному тракті, а також до суттєвого підвищення проникності стінок тонкої кишки щурів з хронічним гепатитом. Компенсаторною реакцією на низьку абсорбцію кальцію в тонкій кишці стало посилення резорбції кісткової тканини щурів з гепатитом, що підтвердилося підвищенням активності кісткової кислої фосфатази та зниженням рівня кальцію в кістковій тканині. Більш значно процес резорбції кісткової тканини був виражений у самців: збільшення резорбції альвеолярної кістки щелеп, тенденція до зниження мінеральної частки кісткової тканини і щільності стегнових, великих гомілкових кісток, поперекових хребців, а також епіфізу та діафізу стегнових кісток.
Отримані результати попередніх етапів дослідження дали підставу для необхідності патогенетичного корегування порушень у кістковій та травній системах тварин з патологією печінки за допомогою протизапальних, антидисбіотичних, гепатопротекторних препаратів та сорбентів.
Тому на заключному етапі роботи провели дослідження профілактичної ефективності комплексу, який складався із гепатопротектора і сорбенту у щурів з тривалим холестазом. Гепатопротектор (Леквін, НВА «Одеська біотехнологія», Україна) містить лецитин, кверцетин, інулін, кальцій, аскорбінову кислоту та володіє гепатопротекторними, антидисбіотичними та протизапальними властивостями. Дієтична добавка (Мінерол, НВМП «ГОБОР», Україна) – глинистий мінерал монтморилоніт з активністю сорбенту і вмістом макро- та мікроелементів. Обидва препарати дозволені для застосування у клініці (Додаток).
Хронічний холестаз, як дуже поширену патологію сучасності, відтворювали у самців щурів шляхом перев’язки жовчної протоки під тіопенталовим наркозом. Профілактичний комплекс препаратів вводили тваринам з холестазом через 3 дні після операції. Тривалість експерименту склала 4 місяці.
Наявність відтворення холестазу підтвердили за визначенням у сироватці крові щурів активності аланінамінотрансферази, еластази, та головного маркеру холестазу – лужної фосфатази, які були підвищені. Аналіз показників ліпідного обміну (тригліцериди, холестерин) у сироватці крові тварин показав наявність порушення метаболізму цих речовин в умовах хронічного холестазу. Також встановлено зниження вмісту кальцію у крові щурів з хронічним холестазом.
Хронічний холестаз сприяв збільшенню органного індексу печінки на 23,5 %, а також зростанню у тканині печінки маркерів запалення (активності еластази, кислої фосфатази), інтенсифікації перекисного окиснення ліпідів (вмісту малонового діальдегіду), зниженню антитоксичної функції печінки (збільшення активності уреази). У слизових оболонках порожнини рота, тонкої та товстої кишок встановлено розвиток запалення (збільшення активності еластази на 28,4-41,1 %, активності кислої фосфатази на 19,3-45,6 %,), активація перекисного окиснення ліпідів (збільшення вмісту малонового діальдегіду на 55,8-127,1 %), пригнічення антиоксидантного (зменшення активності каталази на 6,5-32,1 %) та антимікробного (зниження активності лізоциму на 44,5-70,6 %) захисту, посилення контамінації умовно-патогенними бактеріями (підвищення активності уреази 40,7-92,3 %) та збільшення ступеня дисбіозу у 3,2-5,5 раза.
Хронічний холестаз призвів до суттєвих порушень у кістковій тканині альвеолярного відростку і стегновій кістці щурів: руйнування білкової матриці (зростання активності еластази на 37,0-56,5 %), посилення гідролізу гідроксиапатиту (збільшення активності кислої фосфатази на 58,4-60,3 %), порушення кісткоутворення, про що свідчило зниження активності маркеру остеобластів – активності лужної фосфатази на 26,5-42,2 % і вмісту кальцію 20,2-42,6 %.
Гістологічний аналіз стегнових кісток у щурів з хронічним холестазом встановив зниження питомого обʼєму хряща суглобових поверхонь епіфізів на 25,8 %, зниження питомого обʼєму кісткового мозку на 14,4 % та зменшення кількості остеобластів на 39,4 % на тлі збільшення питомого обʼєму кісткових балок на 33,1 %.
Тобто загалом показано, що патологія холестазу викликає такі ж зміни у печінці, слизових оболонках травного тракту і, як наслідок, у кістковій тканині тварин, як і при токсичному пошкодженні печінки.
Проведення профілактики ефективно попереджувало встановлені зміни у печінці та сироватці крові щурів з холестазом, а також сприяло збереженню показників запалення, антимікробного та антиоксидантного захисту, ступеня контамінації умовно-патогенними бактеріями та дисбіозу у травному тракті щурів на нормальному рівні. Профілактичне введення гепатопротектора, сорбента і джерела мінералів гальмувало процеси резорбції кісткової тканини, нормалізувало вміст кальцію та збільшувало рівень мінералізуючого індексу. Остеопротекторна дія профілактичного комплексу більш виражена у тканині альвеолярного відростка щурів з холестазом.
Встановлені ефекти профілактичного комплексу проявилися завдяки таким компонентам гепатопротектора: лецитин і кверцетин, які володіють гепатопротекторними, антиоксидантними, протизапальними та жовчорозріджувальними властивостями, інулін з антидисбіотичною дією, кальцій та аскорбінова кислота. У поєднанні з сорбентом, який знижував рівень інтоксикації організму тварин в умовах холестазу, застосування гепатопротектора дозволило підтримати метаболічні функції печінки в межах норми, в результаті – попередити дисбіотичні та запальні процеси у слизових
оболонках травного тракту, і, як наслідок, нормалізувати процеси ремоделювання в кістковій тканині тварин хворих на холестаз.
Dissertation for obtaining the scientific degree of Candidate of Biological Sciences (Doctor of Philosophy) in the specialty 091 Biology Odesa I. I. Mechnikov National University, Odesa, 2023. The dissertation is devoted to elucidating the dysbiotic mechanism of the development of osteodystrophy, which is induced by pathology of the liver or gall bladder in laboratory rats, as well as to the justification of the prevention of dysbiosis and disorders in bone tissue caused by hepatobiliary pathology. Three experiments on laboratory rats are planned for the realization of the goal and the fulfillment of research tasks. During the research, the rats were kept in accordance with the rules for working with experimental animals, established by the Directive of the European Parliament and the Council (2010/63/EU) and the order of the Ministry of Education and Science, Youth and Sports of Ukraine dated 01.03.2012 No. 249, the rats were on permanent food and the drinking regime of the vivarium of the Mechnikov National University. The task of the first stage of the work was to find out the condition of the main part of the digestive tract in which nutrients are absorbed, the mucous membrane of the small intestine in rats with toxic hepatitis, which was simulated by administering hydrazine sulfate at a dose of 50 mg/kg twice a week for a month. Based on the determination of biochemical indicators of inflammation in the liver (activity of elastase and acid phosphatase), "hepatic" markers in blood serum (activity of alanine aminotransferase, alkaline phosphatase and bilirubin content), inflammation of the parenchyma and damage to liver cells, i.e. the presence of toxic hepatitis in animals, were determined.The condition of the mucous membrane of the small intestine of rats was assessed by indicators of inflammation (elastase and acid phosphatase activity), contamination with opportunistic bacteria (urease activity), antimicrobial factor (lysozyme activity) and the degree of dysbiosis.Against the background of the development of toxic hepatitis in the mucous membrane of the small intestine, signs of inflammation, a decrease in antimicrobial protection, increased reproduction of pathogenic microbiota and the development of dysbiosis were registered.The established changes in the liver and small intestine of rats indicate a violation of one of the important functions of the liver - antimicrobial, as a result of which an increase in the rate of contamination with opportunistic microbiota and the development of dysbiosis in the mucous membrane of the small intestine were observed. The obtained results allow us to make an assumption: inflammation and dysbiosis in the mucous membrane of the small intestine of animals with liver pathology will lead to deterioration of the last stage of hydrolysis of nutrients and their absorption into the blood and lymph. In turn, the deficiency of necessary components can cause dystrophic changes in tissues and organs, in particular in the bones of animals with hepatobiliary pathology. Therefore, at the next stage of the work, widespread studies were conducted on the absorption of calcium and amino acids in an isolated area of the small intestine, the degree of absorption of calcium as the main component of bone tissue, the permeability of the wall of the small intestine, markers of inflammation and dysbiosis in all departments of the digestive tract of male and female rats, which modeled toxic hepatitis by administering hydrazine sulfate at a dose of 50 mg/kg twice a week for three months.According to morphometric parameters (alveolar bone atrophy, density, content of the mineral-organic component, separately mineral and organic component of bones), the condition of the alveolar bone of the jaws, femurs, large tibias, lumbar vertebrae, as well as separately the epiphysis and diaphysis of the femurs of rats with chronic toxic hepatitis. The obtained results of determining the composition of peripheral blood, biochemical analysis of blood serum and liver tissue of rats, which were injected with a solution of sulfuric acid hydrazine twice a week for three months, indicate the presence of liver damage and general inflammation in animals, which can be interpreted as a manifestation of toxic hepatitis.One of the negative consequences of toxic damage to the liver is a decrease in its ability to perform an antimicrobial function and neutralize opportunistic bacteria and their toxins. Long-term administration of hydrazine sulfate to rats led to a decrease in the absorption and assimilation of calcium in the mucous membrane of the small intestine, which was partially compensated by inhibition of the renal excretion of this element. Calcium, which was not absorbed into the blood in the small intestine of sick animals, was excreted with feces. Chronic hepatitis did not affect the absorption of amino acids in the mucous membrane of the small intestine. The conducted study established insufficient absorption of calcium in the digestive tract of rats with chronic hepatitis. An isolated area of the small intestine of animals showed a 2.2-3.5 times increase in the permeability of its wall in rats with hepatitis, more pronounced in males. The results of a biochemical study of the gums and mucous membranes of the small and large intestines of rats with toxic hepatitis indicate the development of inflammation, cell damage, intensification of lipid peroxidation (increase in the activity of elastase by 21.9-39.0 %, acid phosphatase by 1.7-97,9 %, the content of malondialdehyde by 22.8-60.9 %), a decrease in non-specific antimicrobial protection, an increase in contamination with opportunistic bacteria and the development of dysbiosis (an increase in urease activity by 12.4-179.4 %, the degree of dysbiosis in 2.2-10.5 times against the background of a decrease in lysozyme activity by 26.1-90.4 %) in the investigated departments of the digestive tract of animals with chronic toxic hepatitis.The established disorders were more pronounced in male rats with chronic toxic hepatitis. Morphometric studies of rat bones showed that hepatitis simulation did not affect the state of the teeth, that is, the carious process in both females and males. At the same time, the development of chronic toxic hepatitis in male rats contributed to an increase in the degree of atrophy of the alveolar process of the jaws and a decrease in the density of the diaphysis of the femur, which indicates the activation of resorption processes in the bone tissue. Modeling the pathology in females had the opposite effect, that is, it did not affect alveolar bone atrophy, but led to a significant increase in the density of lumbar vertebrae, large tibiae, femurs and their epiphysis. Determination of the mineral and organic fraction of the lumbar vertebrae, large tibia bones, and diaphysis of the femurs established that the increase in the density of these bones in females with hepatitis occurred due to an increase in the mineral component of bone tissue. The decrease in the density of the femur diaphysis in males with toxic hepatitis occurred due to a decrease in the mineral content of bone tissue. Biochemical studies of bone tissue of the alveolar process and femurs of rats also showed divergent processes in the bone tissue of females and males with toxic hepatitis.Thus, in the bone tissue of females with hepatitis, a more intense destruction of the organic matrix under the influence of bone elastase and a compensatory increase in osteogenesis with the participation of bone alkaline phosphatase was established (increase in elastase activity by 31.2-39.8 %, increase in alkaline phosphatase activity by 61.7-77.3 %), which can explain the increase in the density of vertebrae in females with pathology.Long-term administration of hydrazine to males led to the opposite processes in bone tissue, namely, to more active destruction of hydroxyapatite under the influence of bone acid phosphatase (an increase in acid phosphatase activity by 88.3-93.7 %), a decrease in calcium content by 16.9-18.3 %, resulting in a decrease in mineral content and bone density, respectively.This can explain the increase in resorption of the alveolar bone of the jaws, as well as the tendency to decrease the mineral content of bone tissue and the density of all the bones examined in male rats with hepatitis. The established regularities allow us to conclude that hepatitis has a negative effect on the metabolism and composition of bone tissue in rats with the compensatory role of estrogens, which, as is known, slow down the rate of bone tissue remodeling and prevent pathological resorption. Thus, the results of the second stage of the study allow us to confirm the assumption that a violation of the antimicrobial function of the liver in hepatitis leads to the development of dysbiotic phenomena, inflammation, intensification of lipid peroxidation in the mucous membranes of the digestive tract, in particular the small intestine, of animals with chronic toxic hepatitis. The established pathological changes lead to a decrease in the absorption of calcium in the mucous membrane of the small intestine and insufficient absorption of it in the digestive tract, as well as to a significant increase in the permeability of the walls of the small intestine of rats with chronic hepatitis.A compensatory reaction to the low absorption of calcium in the small intestine was an increase in the resorption of bone tissue in rats with hepatitis, which was confirmed by an increase in the activity of bone acid phosphatase and a decrease in the level of calcium in bone tissue.The process of bone tissue resorption was more pronounced in males: an increase in resorption of alveolar bone of the jaws, a tendency to decrease the mineral fraction of bone tissue and the density of femurs, large tibias, lumbar vertebrae, as well as the epiphysis and diaphysis of femurs. The obtained results of the previous stages of the study provided the basis for the need for pathogenetic correction of disorders in the bone and digestive systems of animals with liver pathology with the help of anti-inflammatory, anti-dysbiotic, hepatoprotective drugs and sorbents. Therefore, at the final stage of the work, a study of the preventive effectiveness of the complex, which consisted of a hepatoprotector and a sorbent, was conducted in rats with long-term cholestasis. Hepatoprotector (Leqin, NVA «Odeska Biotechnology», Ukraine) contains lecithin, quercetin, inulin, calcium, ascorbic acid and has hepatoprotective, anti-dysbiotic and anti-inflammatory properties. Dietary supplement (Minerol, NVMP «GOBOR», Ukraine) is a clay mineral montmorillonite with sorbent activity and mineral content. Both drugs are approved for clinical use. Chronic cholestasis, as a very common modern pathology, was reproduced in male rats by ligation of the bile duct under thiopental anesthesia. A prophylactic complex of drugs was administered to animals with cholestasis 3 days after surgery. The duration of the experiment was 4 months. The presence of reproduction of cholestasis was confirmed by determining the activity of alanine aminotransferase, elastase, and alkaline phosphatase, the main marker of cholestasis, in the blood serum of rats, which were elevated. Analysis of indicators of lipid metabolism (triglycerides, cholesterol) in the blood serum of animals showed the presence of a violation of the metabolism of these substances in conditions of chronic cholestasis. A decrease in calcium content in the blood of rats with chronic cholestasis was also established. Chronic cholestasis contributed to an increase in the organ index of the liver of rats, and in the liver tissue to an increase in markers of inflammation (elastase, acid phosphatase activity), intensification of lipid peroxidation (malondialdehyde content), and a decrease in the antitoxic function of the liver (increase in urease activity).In the mucous membranes of the oral cavity, small and large intestines, the development of inflammation was established (increase in acid phosphatase activity by 19.3-45.6 %, elastase activity by 28.4-41.1 %), activation of lipid peroxidation (increase in the content of malondialdehyde by 55.8-127.1 %), suppression of antioxidant (decrease in catalase activity by 6.5-32.1 %) and antimicrobial (decrease in lysozyme activity by 44.5-70.6 %) protection, increased contamination by opportunistic pathogens bacteria (an increase in urease activity by 40.7-92.3 %) and an increase in the degree of dysbiosis by 3.2-5.5 times. Chronic cholestasis led to significant disturbances in the bone tissue of the alveolar process and the femur of rats: destruction of the protein matrix due to the activation of elastase (increase in elastase activity by 37.0-56.5 %), increased hydrolysis of hydroxyapatite by the action of acid phosphatase (increase in the activity of acid phosphatase by 58.4-60.3 %), a violation of bone formation, which was evidenced by a decrease in the activity of the osteoblast marker - alkaline phosphatase activity by 26.5-42.2 % and calcium content by 20.2-42.6 %. Histological analysis of femurs in rats with chronic cholestasis revealed a decrease in the specific volume of the cartilage of the articular surfaces of the epiphyses by 25.8 %, a decrease in the specific volume of bone marrow by 14.4 %, and a decrease in the number of osteoblasts by 39.4 % against the background of an increase in the specific volume of bone beams by 33.1 %. That is, in general, it is shown that the pathology of cholestasis causes the same changes in the liver, mucous membranes of the digestive tract and, as a result, in the bone tissue of animals, as in the case of toxic damage to the liver. Conducting prevention effectively prevented established changes in the liver and blood serum of rats with cholestasis, and also contributed to the maintenance of indicators of inflammation, antimicrobial and antioxidant protection, the degree of contamination with opportunistic bacteria and dysbiosis in the digestive tract of rats with cholestasis at a normal level. Prophylactic administration of hepatoprotector and sorbent inhibited bone resorption processes, normalized the calcium content and increased the level of the mineralization index. The osteoprotective effect of the prophylactic complex is more pronounced in the tissue of the alveolar process of rats with cholestasis. The established effects of the drugs were manifested due to the following components of hepatoprotector: lecithin and quercetin, which have hepatoprotective, antioxidant, anti-inflammatory and choleretic properties, inulin with an antidysbiotic effect, calcium and ascorbic. acid. In combination with the sorbent, which reduced the level of toxicity of the animal body in cholestasis conditions, the use of hepatoprotector made it possible to preserve the antitoxic function of the liver and support its metabolic functions within normal limits, as a result - to prevent dysbiotic and inflammatory processes in the mucous membranes of the digestive tract, and, as a consequence , to normalize remodeling processes in the bone tissue of animals suffering from cholestasis.
Dissertation for obtaining the scientific degree of Candidate of Biological Sciences (Doctor of Philosophy) in the specialty 091 Biology Odesa I. I. Mechnikov National University, Odesa, 2023. The dissertation is devoted to elucidating the dysbiotic mechanism of the development of osteodystrophy, which is induced by pathology of the liver or gall bladder in laboratory rats, as well as to the justification of the prevention of dysbiosis and disorders in bone tissue caused by hepatobiliary pathology. Three experiments on laboratory rats are planned for the realization of the goal and the fulfillment of research tasks. During the research, the rats were kept in accordance with the rules for working with experimental animals, established by the Directive of the European Parliament and the Council (2010/63/EU) and the order of the Ministry of Education and Science, Youth and Sports of Ukraine dated 01.03.2012 No. 249, the rats were on permanent food and the drinking regime of the vivarium of the Mechnikov National University. The task of the first stage of the work was to find out the condition of the main part of the digestive tract in which nutrients are absorbed, the mucous membrane of the small intestine in rats with toxic hepatitis, which was simulated by administering hydrazine sulfate at a dose of 50 mg/kg twice a week for a month. Based on the determination of biochemical indicators of inflammation in the liver (activity of elastase and acid phosphatase), "hepatic" markers in blood serum (activity of alanine aminotransferase, alkaline phosphatase and bilirubin content), inflammation of the parenchyma and damage to liver cells, i.e. the presence of toxic hepatitis in animals, were determined.The condition of the mucous membrane of the small intestine of rats was assessed by indicators of inflammation (elastase and acid phosphatase activity), contamination with opportunistic bacteria (urease activity), antimicrobial factor (lysozyme activity) and the degree of dysbiosis.Against the background of the development of toxic hepatitis in the mucous membrane of the small intestine, signs of inflammation, a decrease in antimicrobial protection, increased reproduction of pathogenic microbiota and the development of dysbiosis were registered.The established changes in the liver and small intestine of rats indicate a violation of one of the important functions of the liver - antimicrobial, as a result of which an increase in the rate of contamination with opportunistic microbiota and the development of dysbiosis in the mucous membrane of the small intestine were observed. The obtained results allow us to make an assumption: inflammation and dysbiosis in the mucous membrane of the small intestine of animals with liver pathology will lead to deterioration of the last stage of hydrolysis of nutrients and their absorption into the blood and lymph. In turn, the deficiency of necessary components can cause dystrophic changes in tissues and organs, in particular in the bones of animals with hepatobiliary pathology. Therefore, at the next stage of the work, widespread studies were conducted on the absorption of calcium and amino acids in an isolated area of the small intestine, the degree of absorption of calcium as the main component of bone tissue, the permeability of the wall of the small intestine, markers of inflammation and dysbiosis in all departments of the digestive tract of male and female rats, which modeled toxic hepatitis by administering hydrazine sulfate at a dose of 50 mg/kg twice a week for three months.According to morphometric parameters (alveolar bone atrophy, density, content of the mineral-organic component, separately mineral and organic component of bones), the condition of the alveolar bone of the jaws, femurs, large tibias, lumbar vertebrae, as well as separately the epiphysis and diaphysis of the femurs of rats with chronic toxic hepatitis. The obtained results of determining the composition of peripheral blood, biochemical analysis of blood serum and liver tissue of rats, which were injected with a solution of sulfuric acid hydrazine twice a week for three months, indicate the presence of liver damage and general inflammation in animals, which can be interpreted as a manifestation of toxic hepatitis.One of the negative consequences of toxic damage to the liver is a decrease in its ability to perform an antimicrobial function and neutralize opportunistic bacteria and their toxins. Long-term administration of hydrazine sulfate to rats led to a decrease in the absorption and assimilation of calcium in the mucous membrane of the small intestine, which was partially compensated by inhibition of the renal excretion of this element. Calcium, which was not absorbed into the blood in the small intestine of sick animals, was excreted with feces. Chronic hepatitis did not affect the absorption of amino acids in the mucous membrane of the small intestine. The conducted study established insufficient absorption of calcium in the digestive tract of rats with chronic hepatitis. An isolated area of the small intestine of animals showed a 2.2-3.5 times increase in the permeability of its wall in rats with hepatitis, more pronounced in males. The results of a biochemical study of the gums and mucous membranes of the small and large intestines of rats with toxic hepatitis indicate the development of inflammation, cell damage, intensification of lipid peroxidation (increase in the activity of elastase by 21.9-39.0 %, acid phosphatase by 1.7-97,9 %, the content of malondialdehyde by 22.8-60.9 %), a decrease in non-specific antimicrobial protection, an increase in contamination with opportunistic bacteria and the development of dysbiosis (an increase in urease activity by 12.4-179.4 %, the degree of dysbiosis in 2.2-10.5 times against the background of a decrease in lysozyme activity by 26.1-90.4 %) in the investigated departments of the digestive tract of animals with chronic toxic hepatitis.The established disorders were more pronounced in male rats with chronic toxic hepatitis. Morphometric studies of rat bones showed that hepatitis simulation did not affect the state of the teeth, that is, the carious process in both females and males. At the same time, the development of chronic toxic hepatitis in male rats contributed to an increase in the degree of atrophy of the alveolar process of the jaws and a decrease in the density of the diaphysis of the femur, which indicates the activation of resorption processes in the bone tissue. Modeling the pathology in females had the opposite effect, that is, it did not affect alveolar bone atrophy, but led to a significant increase in the density of lumbar vertebrae, large tibiae, femurs and their epiphysis. Determination of the mineral and organic fraction of the lumbar vertebrae, large tibia bones, and diaphysis of the femurs established that the increase in the density of these bones in females with hepatitis occurred due to an increase in the mineral component of bone tissue. The decrease in the density of the femur diaphysis in males with toxic hepatitis occurred due to a decrease in the mineral content of bone tissue. Biochemical studies of bone tissue of the alveolar process and femurs of rats also showed divergent processes in the bone tissue of females and males with toxic hepatitis.Thus, in the bone tissue of females with hepatitis, a more intense destruction of the organic matrix under the influence of bone elastase and a compensatory increase in osteogenesis with the participation of bone alkaline phosphatase was established (increase in elastase activity by 31.2-39.8 %, increase in alkaline phosphatase activity by 61.7-77.3 %), which can explain the increase in the density of vertebrae in females with pathology.Long-term administration of hydrazine to males led to the opposite processes in bone tissue, namely, to more active destruction of hydroxyapatite under the influence of bone acid phosphatase (an increase in acid phosphatase activity by 88.3-93.7 %), a decrease in calcium content by 16.9-18.3 %, resulting in a decrease in mineral content and bone density, respectively.This can explain the increase in resorption of the alveolar bone of the jaws, as well as the tendency to decrease the mineral content of bone tissue and the density of all the bones examined in male rats with hepatitis. The established regularities allow us to conclude that hepatitis has a negative effect on the metabolism and composition of bone tissue in rats with the compensatory role of estrogens, which, as is known, slow down the rate of bone tissue remodeling and prevent pathological resorption. Thus, the results of the second stage of the study allow us to confirm the assumption that a violation of the antimicrobial function of the liver in hepatitis leads to the development of dysbiotic phenomena, inflammation, intensification of lipid peroxidation in the mucous membranes of the digestive tract, in particular the small intestine, of animals with chronic toxic hepatitis. The established pathological changes lead to a decrease in the absorption of calcium in the mucous membrane of the small intestine and insufficient absorption of it in the digestive tract, as well as to a significant increase in the permeability of the walls of the small intestine of rats with chronic hepatitis.A compensatory reaction to the low absorption of calcium in the small intestine was an increase in the resorption of bone tissue in rats with hepatitis, which was confirmed by an increase in the activity of bone acid phosphatase and a decrease in the level of calcium in bone tissue.The process of bone tissue resorption was more pronounced in males: an increase in resorption of alveolar bone of the jaws, a tendency to decrease the mineral fraction of bone tissue and the density of femurs, large tibias, lumbar vertebrae, as well as the epiphysis and diaphysis of femurs. The obtained results of the previous stages of the study provided the basis for the need for pathogenetic correction of disorders in the bone and digestive systems of animals with liver pathology with the help of anti-inflammatory, anti-dysbiotic, hepatoprotective drugs and sorbents. Therefore, at the final stage of the work, a study of the preventive effectiveness of the complex, which consisted of a hepatoprotector and a sorbent, was conducted in rats with long-term cholestasis. Hepatoprotector (Leqin, NVA «Odeska Biotechnology», Ukraine) contains lecithin, quercetin, inulin, calcium, ascorbic acid and has hepatoprotective, anti-dysbiotic and anti-inflammatory properties. Dietary supplement (Minerol, NVMP «GOBOR», Ukraine) is a clay mineral montmorillonite with sorbent activity and mineral content. Both drugs are approved for clinical use. Chronic cholestasis, as a very common modern pathology, was reproduced in male rats by ligation of the bile duct under thiopental anesthesia. A prophylactic complex of drugs was administered to animals with cholestasis 3 days after surgery. The duration of the experiment was 4 months. The presence of reproduction of cholestasis was confirmed by determining the activity of alanine aminotransferase, elastase, and alkaline phosphatase, the main marker of cholestasis, in the blood serum of rats, which were elevated. Analysis of indicators of lipid metabolism (triglycerides, cholesterol) in the blood serum of animals showed the presence of a violation of the metabolism of these substances in conditions of chronic cholestasis. A decrease in calcium content in the blood of rats with chronic cholestasis was also established. Chronic cholestasis contributed to an increase in the organ index of the liver of rats, and in the liver tissue to an increase in markers of inflammation (elastase, acid phosphatase activity), intensification of lipid peroxidation (malondialdehyde content), and a decrease in the antitoxic function of the liver (increase in urease activity).In the mucous membranes of the oral cavity, small and large intestines, the development of inflammation was established (increase in acid phosphatase activity by 19.3-45.6 %, elastase activity by 28.4-41.1 %), activation of lipid peroxidation (increase in the content of malondialdehyde by 55.8-127.1 %), suppression of antioxidant (decrease in catalase activity by 6.5-32.1 %) and antimicrobial (decrease in lysozyme activity by 44.5-70.6 %) protection, increased contamination by opportunistic pathogens bacteria (an increase in urease activity by 40.7-92.3 %) and an increase in the degree of dysbiosis by 3.2-5.5 times. Chronic cholestasis led to significant disturbances in the bone tissue of the alveolar process and the femur of rats: destruction of the protein matrix due to the activation of elastase (increase in elastase activity by 37.0-56.5 %), increased hydrolysis of hydroxyapatite by the action of acid phosphatase (increase in the activity of acid phosphatase by 58.4-60.3 %), a violation of bone formation, which was evidenced by a decrease in the activity of the osteoblast marker - alkaline phosphatase activity by 26.5-42.2 % and calcium content by 20.2-42.6 %. Histological analysis of femurs in rats with chronic cholestasis revealed a decrease in the specific volume of the cartilage of the articular surfaces of the epiphyses by 25.8 %, a decrease in the specific volume of bone marrow by 14.4 %, and a decrease in the number of osteoblasts by 39.4 % against the background of an increase in the specific volume of bone beams by 33.1 %. That is, in general, it is shown that the pathology of cholestasis causes the same changes in the liver, mucous membranes of the digestive tract and, as a result, in the bone tissue of animals, as in the case of toxic damage to the liver. Conducting prevention effectively prevented established changes in the liver and blood serum of rats with cholestasis, and also contributed to the maintenance of indicators of inflammation, antimicrobial and antioxidant protection, the degree of contamination with opportunistic bacteria and dysbiosis in the digestive tract of rats with cholestasis at a normal level. Prophylactic administration of hepatoprotector and sorbent inhibited bone resorption processes, normalized the calcium content and increased the level of the mineralization index. The osteoprotective effect of the prophylactic complex is more pronounced in the tissue of the alveolar process of rats with cholestasis. The established effects of the drugs were manifested due to the following components of hepatoprotector: lecithin and quercetin, which have hepatoprotective, antioxidant, anti-inflammatory and choleretic properties, inulin with an antidysbiotic effect, calcium and ascorbic. acid. In combination with the sorbent, which reduced the level of toxicity of the animal body in cholestasis conditions, the use of hepatoprotector made it possible to preserve the antitoxic function of the liver and support its metabolic functions within normal limits, as a result - to prevent dysbiotic and inflammatory processes in the mucous membranes of the digestive tract, and, as a consequence , to normalize remodeling processes in the bone tissue of animals suffering from cholestasis.
Опис
Ключові слова
щури, печінка, жовчний міхур, кістки, остеодистрофія, травний тракт, запалення, дисбіоз, всмоктування кальцію, гепатопротектор, сорбент, антидисбіотична, антиоксидантна, протизапальна дія, rats, liver, gall bladder, bones, osteodystrophy, digestive tract, inflammation, dysbiosis, calcium absorption, hepatoprotector, sorbent, antidysbiotic, antioxidant, anti-inflammatory
Бібліографічний опис
Косенко Т. В. Роль дисбіозу у розвитку печінкової остеодистрофії : дис. … д-ра філос. : спец. 091 «Біологія» галузі 09 «Біологія» / Т. В. Косенко ; Одес. нац. ун-т ім. І. І. Мечникова. – Одеса, 2023. – 181 с.